De lijn werd in delen geopend vanwege de overbruggingen van grote rivieren, waarvan de brug met de grootste overspanning bij Culemborg (is ook 's werelds langste overspanning geweest). Op 1 januari 1868 was het tracégedeelte Boxtel - Vught gereed en op 1 november 1868 de tracégedeelten Utrecht - Waardenburg (met de spoorbrug over de Lek bij Culemborg) en 's Hertogenbosch - Vught. Op 1 november 1869 was de spoorbrug over de Waal bij Zaltbommel plus het tracégedeelte Waardenburg - Hedel gereed. Tenslotte werd met het gereedkomen van de spoorbruggen bij Hedel (over de Maas) en 's Hertogenbosch (over de Zuid-Willemsvaart) en het tracégedeelte Hedel - 's Hertogenbosch op 15 september 1870 de hele lijn voltooid.

De lijn werd vanaf het begin geëxploiteerd door de SS (Maatschappij tot Exploitatie van de Staatsspoorwegen).

Op 1 januari 1874 werd station Utrecht SS gesloten en werd station Utrecht Centraal (toen NRS) het begin van deze lijn. Het terrein van Utrecht SS werd later Utrecht GE.

In november 1882 kreeg station Geldermalsen aansluiting op de spoorlijn Elst - Gerdermalsen - Dordrecht (Merwe- en Waalspoorweg of Betuwelijn). Hierdoor werd het station groter en (iets) belangrijker.

Ten behoeve van de aanleg van het Amsterdam-Rijnkanaal werd er ten zuiden van Houten een brug gebouwd.

Vanaf 1938/1939 werd de exploitatie en eigendom van deze lijn overgenomen door de NS (Nederlandse Spoorwegen). In 1938 werd ook de spoorlijn geëlektrificeerd en in een keer voltooid.

In 2000/2007 kreeg station Geldermalsen ook verbinding met de Betuweroute.

In 2003 ging het beheer en eigendom van de lijn over naar ProRail.

In 2007 werd begonnen met de spoorverdubbeling bij Houten tussen de Fortweg (ten zuiden van de A12) en de brug over het Amsterdam-Rijnkanaal. Dankzij deze verdubbeling, die onderdeel is van het project Randstadspoor, kunnen de stoptreinen in Houten ingehaald worden en kunnen ze stoppen in Houten Castellum, waardoor de tram kan vervallen.

Later wordt ook de verbinding tussen Houten en Utrecht verdubbeld voor Randstadspoor.

Momenteel is de spoorlijn nog steeds een belangrijke Noord-Zuidverbinding tussen het midden en noorden van Nederland en het zuiden van Nederland. En rijden er intercity's vanaf Amsterdam via deze spoorlijn naar Heerlen en Maastricht en vice versa.